Quelle: Bobby Rajesh Malhotra – Twitter: @Bobby_Netzwerk
Teil II
“Ein PCR-Test wird zusammengeschustert”
“Erst passen die Temperaturen nicht, dann retten man sich zu 45 Testzyklen ein wissenschaftliches No-Go”
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Tweets 23-45 vergleichen qPCR-Protokoll-Best-Practice-Beispiele VS Drosten’s Einreichung am 13. Januar bei der WHO die 8 Tage später, am 21. Januar (2 Tage vor der PubMed rls) nach einem Update (17. Januar, Version 1.1 bis 2.1) offiziell veröffentlicht wurde. https://bit.ly/31Iowwm
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Ein 101-Video über die sehr “kreativen” Primer und Sonden, die auch teilweise hakenförmig arbeiten:
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Grossartiges einfaches Video zum Verständnis der Schritte einer Echtzeit-qPCR: https://youtu.be/ThG_02miq-4 /
danke für @ale_battini für das Aufzeigen. Er ist auch gerade dabei, die RT-qPCR-Testreligion atm zu sezieren, soweit ich das beobachten kann.
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PCRtest-protocol 101-a):Das rezensierte(!) Papier beschreibt PCR-Primer und Sonden, wie es für Protokolle üblich ist, obwohl in der Publikation unterschiedliche Messskalen veröffentlicht werden. Die Nomenklatur fail:nM (nmol/l=nano-molar/liter) ist ok, nm (Nanometer) nicht. http://archive.is/zEdlk
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PCRtest-Protokoll 101-b):
Das Drosten-Papier beschreibt ungewöhnlich hohe und variierende Primer-Konzentrationen.1 der Vorwärts-Primer und 3 der Rückwärts-Primer sind abwegig. Standard-PCR-Testprotokolle bestehen standardmäßig aus 100 nM oder bis zu 200 nM (bis zum 5- bis 8-fachen über dem Standard).
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PCR-Test-Protokoll 101-c): Wobble-Bases definieren Spots innerhalb der Primer-Sequenzen, die sich unterscheiden können: In Drosten’s Papier sehen wir W ist A/T;R ist G/A;M ist A/C;S ist G/C-6 Spots insgesamt – für solche spezifischen Primer in Bezug auf PCR-Tests; diese hohe Anzahl von Varianten ist ungewöhnlich.
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Die Teststrategie innerhalb der WHO-Protokoll (https://bit.ly/3jrysjN) vorschlägt: Zuerst das E-Gen, dann das RdRp-Gen als Kontrolle, was in unserem Fall 3 Unsicherheiten hat; zusätzlich bestätigend: N-Gen.
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Wäre dies durchgezogen worden, hätten wir überhaupt keine positiven Tests.
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Dieser 3-Stufen-Vorschlag von Drosten würde bei jedem Faltschritt jeden Fehler/jede Unsicherheit minimieren, bis nichts mehr übrig bleibt, was auch darauf hindeutet, dass deshalb in fast allen Testverfahren weltweit nur 2 Primer-Matches statt aller 3 wie in dem WHO-Protokoll vorgeschlagen verwendet wurden.
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Es ist verblüffend, dass Drostens Tabelle 1 keine “Tm”-Werte (Glühtemperatur) und keine “GC%”-Werte (Anzahl von G und C in den Sequenzen als %-Wert der Gesamtbasen) zeigt. Wir können Best-Practice-Werte durch Open-Source-Testkontrollen für alle Primer testen. https://archive.is/tnHlc
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Ein Reverse Primer hat einen sehr niedrigen GC%-Wert (28%), je höher der GC%-Wert, desto höher die Bindungsfähigkeiten in Bezug auf die eigentliche Zielsequenz. Die Annealing-Temperatur bestimmt, bei welcher Temperatur sich der Primer von der Zielsequenz ablöst.
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D.h. damit eine Zielsequenz erkannt wird, muss eine Temperatur gewählt werden, die möglichst nahe an der tatsächlichen Annealing-Temperatur (Best Practice-Wert) liegt, damit sich der Primer nicht wieder ablöst und gleichzeitig auch nur auf die Zielsequenz abzielt.
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Ist der “TM”-Wert sehr niedrig, dann kann der Primer mit etwas Unspezifischem & Unwesentlichem binden, wobei nur wenige Fehler innerhalb des Protokollprozesses berücksichtigt werden müssen (wir haben hier eine hohe Anzahl von Wobble-Bases).
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Gute “TM”-Werte sind entscheidend für die Bewertung der Genauigkeit von qPCR-Protokollen. Beste Praxis: Beide Primer (vorwärts und rückwärts) sollten einen fast ähnlichen Wert haben, im besten Fall den exakt gleichen Wert.
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Normal: Bereiche von 40-60 % für den “GC%”-Gehalt und 55-65° C für die Annealing-Temperaturen. In diesem Fall würden wir einen “TM”-Wert von 60° C anstreben, während wir in ähnlicher Weise den höchstmöglichen “CG%”-Wert für alle Primer anstreben.
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Ein maximaler Unterschied von 1° C ist akzeptabel. Wir haben einen Unterschied von 10° C in Drostens qPCR-Protokoll, deshalb ist sein Protokoll sehr fehleranfällig und kann nicht für eine endgültige Analyse verwendet werden.
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Ein Postgraduierter müsste ganz von vorne anfangen, wenn man irgendwo Drostens Werte als qPCR-Protokoll einreichen würde.
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Weitere Tests dieser Best Practices zeigen, dass Drosten & Corman für das N-Gen-Primer-Paar zumindest ziemlich “ok-ish”-Werte erreicht haben. Wir sehen einen fairen “GC%”-Wert für beide Primer (rückwärts & vorwärts) & 1,85° C Unterschied zwischen ihnen.
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Das Resümee von Drostens qPCR-Protokoll-Einreichung bei WHO,Eurosurveillance & Pubmed ist dennoch eine Niederlage: Wissenschaftlich & technisch weit entfernt von Peek-Performance & Best Practices auf dem Gebiet.
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Wenn wir das RdRP-Gen vorwärts & rückwärts – Primer – erneut untersuchen und uns nur auf den umgekehrten “TM”-Wert konzentrieren, werden wir feststellen, dass das eingereichte WHO-Protokoll den Wert von 58° C aufweist, was wiederum 5° C mehr ist, als der Best-Practice-Wert vermuten lässt.
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Es scheint ein Wunder zu sein, dass es bei Drostens qPCR-Protokoll, das am 13. Januar bei der WHO eingereicht und dort am 21. Januar 2020 offiziell als Empfehlung veröffentlicht wurde, zu irgendeiner Art von Anerkennung und Verstärkung kommt: https://bit.ly/31Iowwm
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Werfen wir einen genaueren Blick auf die empfohlenen Zyklen / CT-Werte im Drosten-Protokoll. Wir können dort einen absurden 45-Zyklen-Wert entdecken. https://bit.ly/3jrysjN
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Das würde einfach folgende Analogie ziehen:
Wir suchen nicht nach der “Nadel im Heuhaufen”, im Gegenteil,
wir würden den Heuhaufen nicht mehr sehen können, weil die Nadelstapel überall verstreut sind. Das ist das Gegenteil von “guter Laborpraxis”.
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Man könnte 45 Zyklen machen, aber dann muss man auch noch einen vernünftigen CT-Wert definieren, ein Analysenergebnis bei bis zu 45 Zyklen ist ein No-go und wissenschaftlich bedeutungslos.
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Man könnte auch 100 Zyklen machen, egal, ein vernünftiger CT-Wert würde immer vorher die wissenschaftliche Bedeutung der Amplifikationsergebnisse definieren. In allen Drosten-Papier-Einreichungen und offiziellen Veröffentlichungen ist nirgendwo ein vernünftiger CT-Wert zu finden.
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Sogar die New York Times berichtete ausnahmsweise einmal zutreffend über die anhaltende kontroverse, wissenschaftliche Diskussion unter Virologen und anderen Forschern / Wissenschaftsbereichen von Bedeutung in Bezug auf
http://archive.is/wNQSx
Quelle: threadreaderapp.com
Quelle: https://cormandrostenreview.com/report/?fbclid=IwAR2CQxPzDZJmH52mwsQj9aer6AZt5c6Fo_YWjHQdBtB6PxVa1jGzdSo7ApI
Quelle: Twitter @WHO @ChariteBerlin @Bobby_Netzwerk @CoronaAusschuss
Bobby Rajesh Malhotra – Twitter: @Bobby_Netzwerk
Quelle: NY-Times
Andreas Nitsche (Tib-Molbiol, jetzt @rki_de), @MarionKoopmans, @MackayIM, @DrTedros (@WHO), @wef
Quelle: https://archive.is
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Aus dem Englischen übersetzt von Ronald Freund
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Trotz Bio-Vertiefung ist mir nicht alles klar geworden – aber das Problem ist nach meiner Ansicht nicht, dass ein Mensch Fehler gemacht hat*, sondern, dass alle, die Bedenken angemeldet haben diffamiert wurden – und das als Person nicht betreffend ihrer Argumente!
Das ist weder wissenschaftlich noch fair, nur traurig. *ich postuliere mal, es war kein Plan
Ich würde gern Eure Angaben nachvollziehen können! Woher habt Ihr eine TM von 63.74 resp. 53.56? In der angegebenen Quelle sind diese Werte nicht zu finden, auch nicht im original Drosten Paper vom Januar!
Wäre also gut, wenn Ihr Euren Artikel entsprechend ergänzen würdet. Danke.